大肠菌群的检验
粪大肠菌细菌来源于人和温血动物的粪便。检出粪大肠菌群表明该化妆品已被粪便污染，有可能存在其它肠道致病菌或寄生虫等病原体的危险。因此粪大肠菌被列为重要的卫生指标菌。
1．测定原理
    检验方法是根据粪大肠菌群所具有的生物特征，如革兰氏阴性无芽孢杆菌在44 ℃培养（24～48）h能发酵乳糖产酸并产气，能在选择性培养基上产生典型菌落，能分解色氨酸产生靛基质。
    2．仪器
   恒温水浴、温度计、显微镜、载玻片、接种环、电炉、三角瓶、试管、小倒管、pH计或pH试纸、高温消毒锅、灭菌吸管、灭菌平皿。
    3．培养基和试剂
   （1）乳糖胆盐培养基：配方见表8-23所示。
表8-23  乳糖胆盐培养基配方

物质                  用量	物质                    用量
蛋白胨                20 g 猪胆盐                5 g 蒸馏水                1000 mL	0．4 ％溴甲酚紫水溶液    2.5 mL 乳糖                   5 g

    制备方法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于蒸馏水中，调pH到7.4，加入指示剂，混匀、分装试管（每支试管中加一个小倒管），在69 kPa压力下灭菌20 min。
   （2）双倍浓度乳糖胆盐培养基
    按上述乳糖胆盐培养基成分，蒸馏水量不变，其它成分加倍。
   （3）伊红美兰（EMB）琼脂：配方见表8-24所示。
表8-24  伊红美兰（EMB）琼脂配方

物质                  用量	物质                  用量
蛋白胨                 10 g 乳糖                   10 g 磷酸氢二钾             10 g     蒸馏水                 1000 mL	2 ％伊红水溶液          20 mL 0.5 ％美红水溶液        13 mL 琼脂                   20 g

制备方法：先将琼脂加到900 mL蒸馏水中，加热溶解，然后加磷酸氢二钾、乳糖及蛋白胨混匀，使之溶解。再以蒸馏水补足至1000 mL，校正pH为7.2～7.4。分装于烧瓶内。在0.1 MPa压力下高压灭菌15 min，备用。临用时加入乳糖并加热熔化琼脂。冷却至60 ℃左右，以无菌方式加入经灭菌的伊红美兰溶液，摇匀，倾注平皿备用。
（4）蛋白胨水（作靛基质试验用）：配方见表8-25所示。
表8-25  蛋白胨水配方

物质                  用量	物质                  用量
蛋白胨（或胰蛋白胨）  20 g 蒸馏水                1000 mL	氯化钠                 5 g

制备方法：将上述成分加热熔化，调pH为7.0～7.2，分装小试管，在0.1 MPa压力下高压灭菌15 min。
（5）靛基质试剂
    柯凡克试剂：将5 g对二甲氨基苯甲醛溶解到75 mL戊醇中，然后缓缓加入浓盐酸25 mL。
    试验方法：接种细菌于蛋白胨水中，于44 ℃培养（24～48）h。沿管壁加柯凡克试剂（0.3～O.5）mL，轻摇试管。阳性者于试剂层显深玫瑰红色。
    蛋白胨应含有丰富的色氨酸，每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。
    （6）革兰氏染色法
1）  染液制备：按表8-26制备染液。
表8-26  染液的制备方法

成分		制备方法
A、结晶紫染色液		将结晶紫1 g溶于20 mL 95 %的乙醇中，然后与80 mL 1 %的草酸铵溶液混合
B、革兰氏碘液		先将1 g碘和2 g碘化钾进行混合，加入少许蒸馏水，充分振荡。待完全溶解后，再加蒸馏水至300 mL。
C、脱色液		95%乙醇
D、复染液	a．沙黄复染液	将0.25 g沙黄溶于10 mL 95 %的乙醇，然后用90 mL蒸馏水稀释。
	b．稀石炭酸复红液	称取碱性复红10 g，研细，加95 %乙醇100 mL，放置过夜，滤纸过滤。取滤液10 mL，加5 %石炭酸水溶液90 mL，即为石炭酸复红液。再取此液10 mL，加水90 mL，即为稀石炭酸复红液。

 
    2）染色法
    ① 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染l min，水洗。
    ② 滴加革兰氏碘液，作用l min，水洗。
③ 滴加95 ％酒精脱色，约30 s，或将酒精滴满整个涂片，立即倾去，再用酒精滴满整个涂片，10 s后水洗。
④ 滴加复染液，复染l min，水洗。待干，镜检。
    3）染色结果
    革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。如用1∶10稀释石碳酸复红染色液作复染液，复染时间仅需10 s。
    4．测定步骤
    （1）取10 mL 1∶10稀释的样品，加到10 mL双倍浓度的乳糖胆盐培养基中，置44 ℃培养箱中培养（24～480h。如不产酸也不产气，则报告为粪大肠菌群阴性。
    （2）如产酸产气，则划线接种到伊红美兰琼脂平板上，在37 ℃培养（18～24）h，同时取该培养液（1～2）滴接种到蛋白胨水中，在44 ℃培养24 h。经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长，大肠菌群在伊红美兰琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落，亦常为大肠菌群，均应注意挑选。
    （3）挑选上述可疑菌落，涂片做革兰氏染色镜检。
    （4）在蛋白胨水培养液中，加入靛基质试剂约0.5 mL，观察靛基质反应，阳性者液面呈玫瑰红色；阴性反应液面呈试剂本色。
    5．检验结果
平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阳性短杆菌，靛基质试剂验阳性，则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。