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食品微生物检测方法优劣比较

样品前处理
相对于传统人工操作模式及重复使用的均质乳钵器和搅拌刀头,目前市场上出现品类丰富的一次性均质袋、与样品隔离的拍打式均质系统及自动化重量梯度稀释仪,不仅实现了样品前处理的自动化、标准化及批量化,而且免除了样品间的交叉污染。

增菌培养及分离
不论传统方法或现代检测技术,受检测灵敏度的限制,食品样本经前处理后多需经过增菌培养、选择性分离后方可用于后续检测分析。传统微生物检测中上述两个步骤耗时长达24-96h,为整个检测流程中的关键限速步骤。因此,建立高效增菌策略以及靶标高度特异性微生物浓缩、分离系统已成为实现微生物快速检测的核心。



2.1 增菌条件优化

为了缩短增菌时间、提高检测效率,国内外许多研究者致力于致病菌选择性增菌条件改良。如通过单因素筛选、正交试验设计优化了水产品中副溶血性弧菌的增菌培养基及培养条件,使其在相同培养时间内的菌液浓度达到国标增菌方法的1.8倍;相对于通用的耗时48h李氏增菌肉汤LB1和LB2两步增菌法,美国学者研发了一步法oPSU增菌肉汤,适用于巴氏杀菌奶和热狗等即食类食品中单增李斯特菌的快速检测。此外,为了满足当前食品致病菌多重化检测的需求,在同一体系内实现多种目标菌共增菌的富集培养基优化也日益受到关注。



如针对沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7及单增李斯特菌的复合培养基SEL,经多重PCR及免疫法验证了其良好的复合增菌效果。国内研究者通过优化也分别获得了可同时富集沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌或单增李斯特菌的共增菌培养基,3种致病菌在优化条件下能以相对一致的速度增殖,增菌液可满足下游多重PCR检测要求,有效提高了检测效率。



2.2  细菌分离与浓缩

近年来,国内外学者开发了多种食源性致病菌的高效分离、浓缩法,基于其原理,主要可分为包括离心、过滤等在内的物理法和赖于免疫反应的吸附法。



2.2.1 密度梯度离心法

离心可将大体积样本中的细菌经沉淀而浓缩,而后加入梯度密度的缓冲液,经多次的离心、洗涤最终实现细菌与食品基质的分离。

尽管离心法在细菌富集中具有一定的优势,但其需经多次离心-洗涤反复循环而实现,耗时且影响浓缩效率;另外,其浓缩对象为所有细菌,缺乏靶标特异性。相对于此,基于抗原-抗体免疫反应的吸附分离法则更显优势。



2.2.2 免疫磁分离技术

免疫磁分离技术是一种高效、特异性微生物富集技术。其原理在于利用磁性微球表面偶联的抗体特异性地吸附样品稀释液中的靶标菌,而后载有致病微生物的磁性颗粒在外加磁场的作用下,向磁极方向聚集,弃去检样混合液,使致病菌得到分离和富集,从而大大缩短了常规检测所需的冗长的增菌时间,提高检测效率。以其高度的靶标特异性及与下游检测技术的良好兼容性在食品微生物快速检测中得到广泛应用。

快速检测技术

传统微生物检测方法包括形态观察、生化鉴定及血清学分型等冗繁的操作,已不能满足现代食品微生物检测对灵敏度、特异性和时效性的要求。



3.1 分子生物学方法

此类方法在基因水平上对靶标微生物进行检测,尤其适用于难培养或抗原结构复杂微生物的鉴定及分型,主要包括PCR、核酸分子杂交及基因芯片等技术。



3.1.1 PCR及其衍生技术

PCR是一种体外酶促合成特定DNA片段的技术,它通过以变性、退火和延伸3个步骤为一个周期的循环反应实现产物的指数级增长。相对于扩增单一靶基因的常规PCR,多重PCR通过在同一反应体系中加入多对特异性引物来实现在同一反应管中同时扩增多个目标基因,可用于同时检测多种微生物或通过多基因交叉确认来进行特定微生物鉴定或种下分型。



实时荧光定量PCR技术是一种通过监测PCR产物荧光信号的实时累积来定性或定量分析起始模板的方法。该法全程封闭式反应且无需PCR后处理,避免了交叉污染及溴化乙锭等有毒物质的使用,具有特异性强、高度自动化等优点。通过选取特异性基因设计引物及探针,qRT-PCR法近年来已在多种致病细菌、霉菌、酵母以及乳酸菌等重要食品微生物指标的定性和定量检测中被广泛应用。



尽管上述PCR及其衍生技术具有高灵敏度、快速等优点,但方法实施所需的昂贵仪器设备严重限制了其在我国食品检测机构的推广应用。



3.1.2 核酸分子杂交技术

核酸分子杂交是利用带有标记的特定DNA或RNA探针与已变性的待检核酸样品进行杂交,若样品中存在与探针互补的靶标序列则二者退火形成带标记的双链,通过对标记物信号有无及强度的检测即可实现微生物定性或定量分析。 分子杂交技术应用的关键在于靶标特异性核酸片段选取及相应探针设计及标记。如以葡糖苷酸酶基因设计核酸探针可用于检测食品中的总大肠杆菌,而其不同致病型的区分则需针对特异毒力基因合成适宜的探针。由于放射性标记存在标记元素的半衰期短、对人体及环境不友好以及需要特殊操作设备等缺陷,近年来已逐渐被非放射性DNA探针检测系统所取代,其主要通过酶促反应将特定的底物转变为生色物质或化学发光物质而达到信号放大的目的。



3.1.3 基因芯片

基因芯片又称DNA微阵列,是一种高通量的核酸分子杂交技术。它通过原位合成或显微打印将一系列探针以预设的次序固定于固相支持介质表面,形成高密度的寡核苷酸阵列,样品经核酸提取、PCR扩增及标记后与芯片上的探针阵列杂交,最后通过荧光扫描或酶学方法检测杂交信号的强度和分布以确定受检样品中特定微生物的存在及丰度。



食品中的微生物种群具有种类广、丰度低、随机性强等特点,传统的培养、鉴定方法往往会掩盖一些低丰度或不易培养的微生物,而PCR、免疫杂交等现代技术则多限于检测一种或少数几种靶标微生物或基因,难以全面分析食品受污染状况。而基因芯片具有高通量、并行化及高度自动化等优点,为食品微生物群落结构研究、食源性致病菌多个毒力、药敏基因的同步化、快速检测等提供了一个有力的平台。



3.2 免疫学方法

免疫学方法是基于抗原-抗体的特异性结合反应发展而成的蛋白质水平上的系列检测方法,相对于分子生物学手段其更直接地靶向微生物特异性基因的表达产物,在一定意义上更具说服力。



3.2.1 酶联免疫吸附测定

酶联免疫吸附法是将抗原-抗体免疫反应的特异性与酶的高效催化作用有机地结合起来的一种固相酶免疫分析方法。相对于传统ELISA的检测限,通过单克隆抗体双夹心法将海产品中副溶血性弧菌的检测灵敏度提高了1000~10000倍;而以新型碳纳米管作为固相吸附材料在沙门氏菌的ELISA检测中亦取得了类似的效果。此外,许多学者还结合PCR技术的倍增放大效果开发PCR-ELISA检测技术,进一步提高检测灵敏度。



酶联荧光免疫分析技术则是近年来在ELISA基础上发展而来的新型免疫荧光检测技术。该技术用荧光底物代替生色底物, 提高了分析灵敏度,增宽测量范围,减少试剂的用量。Mini-VIDAS即是法国梅里埃公司根据上述原理开发的一款全自动酶联免疫荧光仪,实现了双抗夹心的ELISA技术的自动化。



3.2.2 免疫层析技术

免疫层析将免疫反应和层析原理相结合, 借助毛细管作用使样品在条状纤维制成的膜上泳动, 其中的待测物与膜上一定区域的配体发生高特异性、高亲和性的免疫结合, 通过酶促显色反应或直接使用着色标记物, 在短时间(20min内)便可得到直观的结果。



随着检测技术的不断发展,免疫层析试纸也不断应用于致病菌定量化检测。此外,在同一免疫层析试纸条上进行多种食品致病菌同步检测的方法也正逐步被开发。通过不同光信号标记



3.2.3 乳胶凝集反应

乳胶凝集反应采用人工大分子乳胶颗粒标记抗体, 使之与待测抗原发生肉眼可见的凝集反应,以达到检测目标病原微生物或毒素的目的。基于乳胶凝集检测法的高灵敏度和特异性以及结果直观性、操作简易度等优势,近年来其在食源性致病菌检测中的应用越发广泛。



3.3 代谢学方法

代谢学方法是指基于微生物在生理代谢过程中发生的特异性物理、化学变化而设计的一系列检测手段,主要包括电阻抗法、ATP发光法和微量生化法等。



3.3.1 阻抗法

阻抗法是一种通过检测细菌在生长繁殖时将电惰性生物大分子代谢为带电荷的活性小分子所引起的培养液电阻和电导的变化来定量表征微生物的新型检测方法。该法因具有高敏感性、特异性、反应快速性以及可重复性等优点而在食品微生物快速检测中被广泛应用。



3.3.2  ATP生物发光法

ATP作为机体的“能量货币”普遍存在于所有活体生物中且含量相对恒定,其随机体死亡亦会被快速分解,因此测定样品中的ATP浓度即可推算出其携带的活菌数。基于此,ATP发光法通过发光光度计检测荧光素酶在ATP的作用下氧化荧光素所产生的荧光强度,并利用其在一定范围内与ATP浓度的线性关系来定量样品中的ATP含量,继而推算系统中代谢活细胞水平。



该方法无需对样本中的微生物进行培养,可在数分钟内完成检测,且荧光光度计小巧便携,尤其适用于大批量食品样本细菌污染状况以及食品加工设备清洁度的现场快速检定。如自动ATP生物荧光技术已在欧洲和北美的乳品工业中广泛应用于生乳活菌数检测、UHT乳活菌数检测、设备清洁度的评估及成品架售期的推算等。



3.3.3  微量生化法

为了满足食品微生物快速化、标准化、批量化检测的需求,目前市场上出现了许多高精密度、高重现性的商品化微量生化鉴定试剂盒,大大提高了检测速率以及结果的重现性。



尽管上述试剂盒已大大简化了传统微生物生化鉴定程序,但其不同反应仍需分别加样且结果依赖人工判读。近年来随着检测科学的不断发展,全自动微生物生化鉴定分析系统也应运而生,通过结合现代计算机技术,该系统可在一次加样后自动完成系列生化检测并通过概率最大近似值模型法分析后直接报告鉴定结果。上述自动生化鉴定系统可在4-6h内同时完成数十个样品的分析,可满足批量化鉴定的需求,且与其他检测方法的结果高度吻合。

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