亲和色谱法（Affinity Chromatography）是一种基于生物分子间特异性相互作用的高选择性分离技术，是化学检验员在分析、纯化和检测生物大分子（如蛋白质、酶、抗体、核酸、多糖等）时的重要手段。它模拟生物体内的识别机制，利用配体与目标分子之间的可逆结合实现高效分离，具有选择性极强、纯化效率高、操作相对温和等优点。

一、基本原理

亲和色谱的核心原理是利用生物分子之间的专一性、可逆的生物亲和作用，如：

酶与底物、抑制剂、辅酶；

抗原与抗体；

激素与受体；

核酸（DNA/RNA）与互补链、结合蛋白；

凝集素与糖蛋白；

金属离子与带有组氨酸标签（His-tag）的重组蛋白。

在亲和色谱中：

固定相：将具有特异性识别能力的配体（Ligand）通过化学偶联固定在惰性载体（如琼脂糖、聚丙烯酰胺、硅胶等）上，形成亲和吸附剂；

流动相：缓冲溶液，用于溶解样品并调节结合与洗脱条件。

当含有目标分子的混合物通过色谱柱时：

特异性结合：目标分子与固定化配体发生特异性结合，被保留在柱上；

杂质洗脱：其他不相关的组分随流动相流出；

特异性洗脱：改变洗脱条件（如pH、离子强度、加入竞争性配体或螯合剂），使目标分子与配体解离，被洗脱下来，实现高纯度分离。

二、仪器与材料

亲和色谱通常在中压或低压液相色谱系统（如FPLC、AKTA系统）或普通层析柱上进行，主要组成部分包括：

亲和色谱柱
内装偶联了配体的亲和介质，如：

Protein A/G 琼脂糖：用于纯化抗体（IgG）；

Ni-NTA 琼脂糖：用于纯化His标签重组蛋白；

谷胱甘肽琼脂糖：用于纯化GST融合蛋白；

肝素琼脂糖：用于纯化DNA结合蛋白、凝血因子；

凝集素琼脂糖：用于糖蛋白分离。

输液系统
泵提供稳定流动相，控制流速。

检测器

紫外检测器（UV）：监测蛋白质在280 nm的吸收；

电导检测器：监测缓冲液离子强度变化。

收集装置
自动馏分收集器，用于收集洗脱峰。

数据处理系统
记录紫外吸收曲线和电导曲线，形成层析图谱。

三、操作流程

柱子平衡
用结合缓冲液（Binding Buffer）冲洗柱子，使配体处于活性状态。

上样
将样品（如细胞裂解液、发酵液、血清）以适当流速加载到柱上，目标分子与配体结合，杂质流出。

洗涤
继续用结合缓冲液或低盐缓冲液冲洗，去除未结合或弱结合的杂质，提高纯度。

洗脱

竞争性洗脱：加入游离配体（如咪唑洗脱His标签蛋白）；

非竞争性洗脱：改变pH、离子强度或使用变性剂（如尿素、盐酸胍）；

洗脱液需立即中和或透析，防止目标蛋白失活。

再生与保存

洗脱后用高盐或再生缓冲液清洗柱子，恢复配体活性；

长期保存用含防腐剂（如20%乙醇）的缓冲液封存。

四、化学检验员典型应用场景

重组蛋白纯化

利用His-tag与Ni²⁺亲和柱快速纯化重组蛋白，是分子生物学和生物制药的常规操作。

抗体纯化

从血清或培养液中纯化IgG类抗体，用于诊断试剂或治疗药物制备。

酶的分离与富集

如利用ATP-琼脂糖纯化激酶，或辅酶A亲和柱纯化脱氢酶。

核酸检测与纯化

生物素化探针与链霉亲和素柱结合，用于RNA或DNA的富集。

药物-蛋白相互作用研究

将药物分子固定在载体上，筛选其结合蛋白，用于靶点发现。

食品安全与生物毒素检测

利用抗体-抗原亲和柱（免疫亲和柱，IAC）净化和富集样品中的毒素（如黄曲霉毒素、赭曲霉毒素）。

五、操作要点与注意事项

配体稳定性：确保配体在操作条件下不脱落；

非特异性吸附：可通过添加去垢剂（如Tween-20）或牛血清白蛋白（BSA）减少；

流速控制：结合阶段流速不宜过快，保证充分结合；

洗脱条件优化：避免剧烈条件导致目标蛋白变性；

柱子寿命：亲和介质较昂贵，需规范操作，避免污染和过度使用；

无菌操作：用于生物制品时需防止微生物污染。

六、优点与局限性

优点：

选择性极高，一步纯化即可获得高纯度产物；

分离条件温和，保持生物活性；

可从复杂基质中富集低丰度目标分子；

适用于实验室和工业规模。

局限性：

配体制备复杂，成本高；

每种亲和柱通常只针对一类分子，通用性差；

配体可能泄漏，影响下游应用；

不适合非生物分子或无特异性识别系统的物质。

七、总结

亲和色谱法是化学检验员在处理生物大分子样品时的“精准捕手”。它凭借分子识别的特异性，实现了传统色谱难以达到的高选择性分离，在生物制药、生命科学研究和高纯度样品制备中发挥着不可替代的作用。

尽管其应用范围相对专一，但随着重组蛋白技术、单克隆抗体和生物传感器的发展，亲和色谱的应用日益广泛。化学检验员掌握其基本原理和操作技能，不仅有助于生物样品的分析与纯化，也为开展更复杂的生物分子相互作用研究奠定了基础。