化学检验员液相色谱分析法
液相色谱分析法（Liquid Chromatography, 简称LC），特别是高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC），是化学检验员在分析难挥发、热不稳定、大分子或强极性化合物时最核心、最常用的分离与检测技术之一。它广泛应用于药品、食品、环境、生物、化工等领域，是现代实验室不可或缺的分析手段。
一、基本原理
液相色谱基于混合物中各组分在固定相和流动相（液体溶剂）之间的分配行为差异实现分离。
流动相：由泵输送的高压液体（如甲醇、乙腈、水、缓冲盐溶液等）；
固定相：填充在色谱柱内的微小颗粒（如硅胶、C18键合硅胶等）。
当样品被注入流动相后，在高压推动下流经色谱柱。不同组分因与固定相和流动相的相互作用力（如吸附、分配、离子交换、分子大小排阻等）不同，导致在柱中停留时间不同，从而实现逐一分离。分离后的组分依次进入检测器，产生信号，形成色谱图。
二、仪器组成（HPLC系统）
溶剂输送系统（高压泵）
提供稳定、无脉动的高压流动相（可达6000 psi以上）；
支持梯度洗脱（两种或以上溶剂按程序比例混合），提高复杂样品分离能力。
进样系统
手动进样器：使用六通阀和微量注射器；
自动进样器：可实现批量进样，提高效率和重复性；
进样量通常为5–100 μL。
色谱柱（核心部件）
C18柱（ODS柱）：反相色谱最常用，适用于非极性或弱极性化合物；
氨基柱、氰基柱：正相色谱，用于极性化合物；
离子交换柱：用于离子型物质（如氨基酸、有机酸）；
凝胶柱（GFC/GPC）：按分子大小分离，用于蛋白质、多糖、聚合物。
常用内径4.6 mm，长度150–250 mm的不锈钢柱；
填料粒径一般为3–5 μm，粒径越小，柱效越高；
常见类型：
柱温箱
控制色谱柱温度，提高分离重复性和效率；
通常设定在25–40°C，也可程序升温。
检测器（关键部件）
LC-MS联用，提供分子量和结构信息，用于复杂体系定性与痕量分析。
适用于无紫外吸收的物质（如糖类、脂类、聚合物）；
可用于梯度洗脱。
通用型，但灵敏度低，不能用于梯度洗脱。
灵敏度高，选择性好，用于天然荧光或可衍生化物质（如多环芳烃、维生素）。
可同时采集全波长光谱，用于峰纯度分析和定性确认。
应用最广，适用于有紫外吸收的物质（如芳香族化合物、药物）；
可选择固定波长或扫描波长。
紫外-可见检测器（UV-Vis）：
二极管阵列检测器（DAD或PDA）：
荧光检测器（FLD）：
示差折光检测器（RID）：
蒸发光散射检测器（ELSD）：
质谱检测器（MS）：
数据处理系统
色谱工作站（如Empower、ChemStation）进行数据采集、峰识别、积分、定量分析。
三、主要分离模式（化学检验员常用）
| 模式 | 原理 | 固定相 | 流动相 | 适用对象 |
|---|---|---|---|---|
| 反相色谱（RP-LC） | 非极性固定相 vs 极性流动相 | C18、C8 | 水/甲醇、水/乙腈 | 大多数有机物（药物、农药、添加剂） |
| 正相色谱（NP-LC） | 极性固定相 vs 非极性流动相 | 硅胶、氨基柱 | 正己烷、氯仿 | 极性化合物、异构体 |
| 离子交换色谱（IC） | 电荷相互作用 | 阴/阳离子交换树脂 | 缓冲溶液 | 有机酸、氨基酸、无机离子 |
| 体积排阻色谱（SEC/GPC） | 分子大小分离 | 多孔凝胶 | 水或有机溶剂 | 蛋白质、多糖、聚合物分子量分布 |
注：反相色谱是应用最广泛的模式，占HPLC分析的80%以上。
四、分析流程
样品前处理
溶解：用流动相或适当溶剂溶解样品；
提取：液液萃取（LLE）、固相萃取（SPE）去除干扰；
过滤：使用0.45 μm或0.22 μm滤膜过滤，防止堵塞色谱柱；
定容：准确稀释至合适浓度。
方法建立与优化
选择色谱柱类型；
设定流动相组成与梯度程序；
设定检测波长、流速、柱温等参数；
使用标准品调试，确保分离良好。
进样分析
先运行空白和标准品；
再依次分析样品。
数据处理
根据保留时间定性；
根据峰面积定量（外标法、内标法）。
五、化学检验员常用应用场景
| 领域 | 应用示例 |
|---|---|
| 药品检验 | 原料药含量测定、有关物质检查、溶出度测定（药典常用） |
| 食品安全 | 食品添加剂（如防腐剂、甜味剂）、非法添加物（如三聚氰胺）、农药残留 |
| 环境分析 | 水中酚类、多环芳烃、抗生素残留 |
| 生物分析 | 蛋白质、多肽、核酸、代谢物分析 |
| 化工产品 | 染料、表面活性剂、高分子材料纯度分析 |
六、操作要点与注意事项
流动相要求：
使用HPLC级溶剂，避免杂质干扰；
水相需过滤（0.45 μm）并脱气（超声或在线脱气），防止气泡影响泵和基线。
色谱柱维护：
使用前需平衡柱子；
避免pH过高（>8）或过低（<2）损坏硅胶柱；
使用保护柱减少污染；
分析结束后用适当溶剂冲洗并保存（如C18柱保存在甲醇或乙腈中）。
进样前过滤：所有样品必须过滤，防止堵塞针头或色谱柱。
避免强保留物质积累：定期用强洗脱溶剂冲洗色谱柱。
基线稳定性：确保检测器稳定，避免温度波动和溶剂不纯。
七、优点与局限性
| 优点 | 局限性 |
|---|---|
| 适用于难挥发、热不稳定、大分子物质 | 仪器成本高，维护复杂 |
| 分离效率高，重现性好 | 流动相消耗大，运行成本较高 |
| 可与多种检测器联用，适应性强 | 方法开发相对复杂 |
| 可实现梯度洗脱，分离复杂混合物 | 对操作人员技术要求高 |
八、总结
液相色谱分析法（尤其是HPLC）是化学检验员进行高精度、高灵敏度分离分析的核心技术。它弥补了气相色谱在热不稳定和难挥发物质分析中的不足，成为现代实验室的“主力分析平台”。
化学检验员应熟练掌握HPLC的基本原理、仪器操作、方法开发、数据处理和日常维护技能。在实际工作中，注重样品前处理规范性、色谱条件优化、标准品使用和质量控制，确保检测结果的准确性、可靠性和可追溯性。
随着超高效液相色谱（UHPLC）和LC-MS/MS技术的发展，液相色谱正朝着更高效率、更高灵敏度、更智能化方向发展，应用前景更加广阔。
