化学检验员掌握紫外-可见吸收光谱法 (Ultraviolet-Visible Absorption Spectroscopy, UV-Vis) 是其在常规化学分析中最基础、最常用的定量分析技能之一。该方法利用物质在紫外（190-400 nm）和可见光（400-800 nm）区域对特定波长光的吸收特性进行定性或定量分析，具有操作简便、快速、成本低、应用广泛等优点。

一、 基本原理

核心原理是朗伯-比尔定律 (Lambert-Beer Law)。

物理过程：

当一束单色光通过溶液时，溶液中的分子（或离子）会吸收特定波长的光。

吸收是由于分子中的价电子（如π电子、n电子）发生能级跃迁（如 π→π*、n→π*）。

不同物质因分子结构不同，其电子能级差不同，因此吸收光的波长（λ）也不同，形成吸收光谱。

朗伯-比尔定律：

A：吸光度 (Absorbance)，无量纲。

ε：摩尔吸光系数 (Molar Absorptivity)，单位 L·mol⁻¹·cm⁻¹。是物质的特征常数，反映其吸光能力。

b：光程（吸收池厚度），单位 cm（通常为1 cm）。

c：溶液浓度，单位 mol/L。

公式：A = εbc

含义：在一定条件下，溶液的吸光度（A）与其浓度（c）和液层厚度（b）成正比。

应用：这是UV-Vis进行定量分析的理论基础。

二、 仪器组成

化学检验员必须熟悉分光光度计的五大核心部分：

光源：

紫外区：氘灯（发射190-400 nm连续光谱）。

可见区：钨灯（或卤钨灯）（发射350-1100 nm连续光谱）。

操作要点：仪器通常自动切换光源，需预热稳定。

单色器：

作用：将光源发出的复合光分解为单色光。

组成：入射狭缝、准直镜、色散元件（棱镜或光栅）、聚焦镜、出射狭缝。

关键参数：波长、狭缝宽度。狭缝宽则光强高但分辨率低；狭缝窄则分辨率高但光强弱、噪声大。

吸收池 (比色皿)：

石英比色皿：可用于紫外和可见光区（190-2500 nm），必须用于波长 < 350 nm 的测量。

玻璃比色皿：仅用于可见光区（>350 nm），成本低。

用于盛放样品溶液和参比溶液。

材质：

规格：最常用光程为1.0 cm。也有0.5 cm, 2 cm, 5 cm, 10 cm等，用于不同浓度范围。

化学检验员重点：使用前必须彻底清洗（可用稀酸、洗涤剂、水、乙醇冲洗），避免残留物造成污染或散射；拿取时只能接触毛玻璃面，避免指纹污染透光面。

检测器：

将光信号转换为电信号。常用光电倍增管 (PMT) 或光电二极管。

信号显示与数据处理系统：

显示吸光度或透光率，绘制吸收光谱，进行定量计算。

三、 标准分析流程（化学检验员实操步骤）

1. 方法选择与波长确定

已知物质：查阅文献或手册，确定其最大吸收波长（λmax）。

未知物质或显色体系：

配制标准溶液或显色后的样品溶液。

在紫外-可见光区进行波长扫描（如200-800 nm）。

记录吸收光谱图，找到最大吸收峰对应的波长 (λmax) 作为定量分析波长。

2. 样品前处理

目的：将待测组分转化为可吸收紫外-可见光的形式，并溶解于合适溶剂中。

常用方法：

直接溶解：适用于本身有吸收的物质。

显色反应：待测物本身无吸收或吸收弱，需与显色剂反应生成有色化合物（如测定铁用邻二氮菲，测定磷酸盐用钼蓝法，测定蛋白质用考马斯亮蓝G-250）。

萃取/分离：从复杂基体中提取待测物。

关键：控制反应条件（pH、温度、时间、试剂用量）以保证反应完全且稳定。

3. 标准溶液配制

使用有证标准物质或高纯试剂，逐级稀释配制一系列浓度的标准溶液（如0.5, 1.0, 2.0, 5.0 mg/L）。

强调：移液管、容量瓶使用规范，稀释操作准确。

4. 仪器准备

开机，预热光源和仪器15-30分钟。

选择正确的波长（λmax）。

（如需要）设置扫描模式或定量模式。

5. 空白校正（调零）

空白溶液：应包含除待测物外的所有试剂和溶剂。例如：

直接测：纯溶剂（如水、乙醇）。

显色测：所有试剂 + 溶剂，但不加待测样品。

将空白溶液装入与样品相同的比色皿中，放入样品室。

按“调零”或“空白”键，使仪器显示A = 0.000。

6. 校准曲线建立

依次将系列标准溶液装入比色皿，放入样品室。

测量各标准溶液的吸光度 (A)。

以浓度 (c) 为横坐标，吸光度 (A) 为纵坐标，在坐标纸上或软件中绘制校准曲线。

检查：

曲线应为通过原点附近的直线。

相关系数 R² > 0.995 为佳，表明线性关系良好。

若曲线弯曲或不过原点，需检查是否偏离朗伯-比尔定律。

7. 样品分析

将待测样品溶液（经前处理后）装入比色皿。

测量其吸光度。

质量控制 (QC)：

平行样：每批样品做10-20%的平行样，相对标准偏差（RSD）应符合要求（如<3%）。

加标回收：在样品中加入已知量标准物质，测定回收率（通常要求90%-110%），评估准确度。

标准物质 (CRM)：分析有证参考物质，验证方法准确性。

重复测量：长时间分析后，重新测量一个标准点，确认仪器漂移。

8. 数据处理与报告

将样品的吸光度代入校准曲线方程（或由仪器软件自动计算），求得样品溶液中的浓度。

结合样品的稀释倍数、称样量、定容体积等，换算为原始样品中的含量（如 mg/L, mg/kg）。

结合QC结果评估数据可靠性。

规范填写原始记录，出具检测报告。

四、 化学检验员注意事项与常见问题

偏离朗伯-比尔定律的原因及消除：

高浓度：分子间相互作用增强。消除：稀释样品至线性范围。

溶液中的化学平衡：如离解、缔合、互变异构等随浓度变化。消除：控制pH、温度、使用掩蔽剂。

非单色光：单色器分辨率不够。消除：选择合适狭缝宽度。

散射光：溶液浑浊或有悬浮物。消除：过滤或离心。

物理因素：

化学因素：

溶剂选择：

溶剂必须在测定波长范围内无吸收或吸收很弱。

常用溶剂：水、乙醇、甲醇、丙酮、正己烷、乙腈等。

注意溶剂极性对吸收光谱的影响（溶剂效应）。

比色皿使用：

匹配性：同一组测量（标准、样品、空白）应使用同一对匹配的比色皿。

清洁：每次使用后立即用溶剂冲洗，避免残留。顽固污渍可用专用清洗液（如铬酸洗液，注意安全！）或超声清洗。

方向：比色皿有方向标记，应保持一致。

气泡：装液后避免气泡，可用软纸轻轻擦拭透光面。

显色反应优化：

显色剂用量：过量以保证反应完全，但过量过多可能引起副反应。

pH值：对显色反应影响极大，需用缓冲溶液精确控制。

反应时间：确保显色完全且稳定（测量应在稳定期内完成）。

温度：温度影响反应速率和平衡。

仪器维护：

定期清洁样品室。

检查光源强度，及时更换寿命到期的灯（如氘灯、钨灯）。

记录仪器使用和维护日志。

五、 应用举例

环境监测：

水中硝酸盐（紫外区直接测定）。

水中六价铬（与二苯碳酰二肼显色）。

水中总磷/磷酸盐（钼蓝法显色）。

食品分析：

食品中亚硝酸盐（格里斯试剂显色）。

食品中蛋白质（双缩脲法、Lowry法、Bradford法显色）。

食品中色素含量。

生物化学：

蛋白质浓度测定（A280，利用Trp/Tyr吸收）。

核酸浓度测定（A260）。

酶动力学研究（监测底物或产物吸光度变化）。

工业分析：

工业品纯度检查。

反应过程监控。

六、 总结

紫外-可见吸收光谱法是化学检验员的“看家本领”。其核心在于朗伯-比尔定律的应用和严谨的实验操作。

化学检验员成功应用UV-Vis的关键在于：

深刻理解原理，能解释偏离定律的现象。

规范操作，特别是比色皿的使用和空白校正。

精通显色分析技术，能优化反应条件。

严格执行质量控制，确保数据准确可靠。

熟练进行数据处理，正确建立和使用校准曲线。

通过掌握UV-Vis技术，化学检验员能够高效、准确地完成大量常规定量分析任务，为产品质量控制、环境监测和科学研究提供基础而关键的数据支持。