化学检验员掌握分光光度法（Spectrophotometry）是进行定量分析的核心技能之一。该方法基于物质对光的选择性吸收，通过测量溶液在特定波长下的吸光度，根据朗伯-比尔定律（Lambert-Beer Law）计算待测组分的浓度，具有灵敏度高、操作简便、应用广泛等优点。

一、 基本原理

光的本质与吸收：

当一束单色光通过溶液时，部分光被溶液吸收，部分透射。

不同物质因分子结构不同，对光的吸收具有选择性，形成特征吸收光谱。

朗伯-比尔定律 (Lambert-Beer Law)：

A：吸光度（Absorbance），无量纲。

ε：摩尔吸光系数（L·mol⁻¹·cm⁻¹），表示物质对光的吸收能力，是物质的特征常数。

b：光程（cm），即比色皿的厚度（常用1cm）。

c：溶液浓度（mol/L）。

公式：A = ε · b · c

物理意义：在一定条件下，溶液的吸光度A与溶液浓度c和液层厚度b成正比。

应用基础：这是分光光度法定量分析的理论依据。

二、 仪器组成与功能

分光光度计主要由以下五部分组成：

光源：

可见光区（400-760nm）：钨灯或卤钨灯。

紫外光区（200-400nm）：氘灯。

功能：提供连续光谱。

单色器：

组成：入射狭缝、准光镜、色散元件（棱镜或光栅）、聚光镜、出射狭缝。

功能：将复合光分解为单色光，并通过调节出射狭缝选择所需波长。

吸收池（比色皿）：

配对使用（同一批次，透光率相近）。

洁净透明，无划痕。

操作时手握毛面，光面朝向光路。

玻璃：用于可见光区。

石英：用于紫外和可见光区（玻璃吸收紫外光）。

材质：

规格：常用1cm光程，也有0.5cm、2cm、5cm等。

使用要求：

检测器：

类型：光电管、光电倍增管（PMT）、硅光电池、CCD等。

功能：将光信号转换为电信号。

信号显示与数据处理系统：

将检测器输出的电信号放大、处理，以吸光度（A）、透光率（T%）或浓度（c）形式显示。

现代仪器多配备计算机软件，可进行波长扫描、标准曲线拟合、浓度计算等。

三、 分析方法与操作步骤

（一） 定量分析方法

标准曲线法（工作曲线法）：

最常用的方法。

步骤：

优点：准确、可靠，适用于批量样品分析。

配制一系列浓度已知的标准溶液。

在最大吸收波长（λ_max） 下，用同一比色皿测量各标准溶液的吸光度。

以浓度（c）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线（通常为过原点的直线）。

在相同条件下测量样品溶液的吸光度。

在标准曲线上查出对应的浓度，或通过线性回归方程计算。

标准对照法（直接比较法）：

条件：待测组分浓度与某一标准溶液浓度相近。

步骤：

优点：简便快捷。

缺点：准确性低于标准曲线法。

配制一个浓度为c_s的标准溶液。

测量标准溶液和样品溶液的吸光度A_s和A_x。

计算：c_x = (A_x / A_s) × c_s

吸光系数法：

前提：已知待测物质的摩尔吸光系数ε。

计算：c = A / (ε · b)

应用：常用于已知化合物的快速测定或ε的测定。

（二） 典型操作流程

开机预热：打开仪器电源，预热15-30分钟，使光源和电子系统稳定。

选择波长：根据待测物质的吸收光谱，选择最大吸收波长（λ_max）。

调零与调百：

调透光率零点（T=0%）：将关闭光路或遮光体放入光路，调节“0%T”旋钮，使显示为0.0。

调透光率100%（T=100%或A=0）：将空白溶液（不含待测组分的试剂溶液）装入比色皿，放入样品室，调节“100%T”旋钮，使显示为100.0%T（或0.000A）。

注意：每次改变波长后，必须重新调零和调百。

测量标准系列：按浓度从低到高，依次测量标准溶液的吸光度。

测量样品：测量样品溶液的吸光度。

数据处理：绘制标准曲线，计算样品浓度。

关机：测量完毕，取出比色皿清洗干净。关闭仪器电源。

四、 化学检验员实践要点

显色反应：

多数无机离子和有机物本身无色或吸收弱，需通过显色反应生成有色化合物。

显色剂：如邻二氮菲（测Fe²⁺）、二苯碳酰二肼（测Cr⁶⁺）、钼酸铵（测PO₄³⁻）。

控制条件：显色时间、温度、pH、显色剂用量等必须严格控制。

空白溶液的选择：

试剂空白：包含所有试剂和溶剂，不含待测物。最常用。

样品空白：含样品基体但不含待测组分，用于扣除基体干扰。

溶剂空白：纯溶剂。

比色皿的使用：

必须配对使用，避免因透光率差异引入误差。

清洗：用蒸馏水冲洗，必要时用稀酸或有机溶剂浸泡，最后用蒸馏水淋洗。

擦拭：用镜头纸或柔软的擦镜布单向擦拭光面，避免产生划痕。

浓度范围控制：

吸光度A的最佳测量范围为0.2 - 0.8（透光率20%-60%）。

A < 0.1或A > 1.0时，相对误差较大。

若样品浓度过高，应稀释；过低，可增大称样量或浓缩。

干扰消除：

掩蔽剂：加入掩蔽剂消除共存离子干扰（如加柠檬酸掩蔽Fe³⁺对Al³⁺测定的干扰）。

分离：通过沉淀、萃取等方法分离干扰组分。

选择波长：选择干扰最小的波长。

仪器校准与维护：

定期用标准滤光片或重铬酸钾溶液校准波长和吸光度准确性。

保持仪器清洁，防尘、防潮、防震。

长期不用时，定期通电。

五、 应用领域

水质分析：测定COD、BOD、氨氮、总磷、六价铬、铁、铜等。

食品分析：测定亚硝酸盐、二氧化硫、蛋白质、色素等。

药品分析：测定有效成分含量、杂质检查。

环境监测：大气中NO₂、SO₂等污染物的测定。

生化分析：测定蛋白质、核酸浓度。

六、 总结

分光光度法是化学检验员的“眼睛”，它能将微小的浓度差异转化为可测量的光学信号。掌握其原理和操作，不仅是学会使用一台仪器，更是理解光与物质相互作用的科学过程。

一个优秀的分光光度分析，始于对显色反应的精准控制，成于对标准曲线的严谨绘制，终于对数据的科学解读。化学检验员必须具备细致、耐心和严谨的职业素养，才能确保每一个吸光度读数都真实可靠，为产品质量、环境安全和科学研究提供坚实的数据支撑。